研究發(fā)現，腸道革蘭氏陰性菌作為主要的驅動因素，調節(jié)腸嗜鉻細胞的色氨酸代謝，腸嗜鉻細胞來源的血清素（serotonin），是連接腸道與Kupffer細胞介導IDS（In vivo delivery systems）清除的關鍵信使。血清素通過Kupffer細胞上的特定受體信號觸發(fā)細胞骨架重塑，并上調與吞噬相關基因的表達，從而廣泛增強Kupffer細胞對各種IDS的攝取。在治療上，通過限制血清素生成的來源食物或阻斷相關受體實現血清素信號的暫時中斷，均可大幅降低肝臟對遞送系統(tǒng)的清除，將化療、溶瘤病毒療法的療效提升三倍以上，并將體細胞基因編輯和mRNA療法的效率提高5至15倍。從而為腫瘤靶向治療、mRNA療法、基因編輯等技術提供普適性療效增強策略。該發(fā)現從機制層面破解了困擾遞送領域數十年的“載體非特異性清除"難題，為推動遞送技術的臨床轉化提供了普適性全新方案。

論文截圖

介紹：

體內傳遞系統(tǒng)（IDSs）對于實現治療劑的臨床應用至關重要，尤其是那些具有低生物利用度或劑量受限的全身毒性的藥物。IDSs 的進展，以聚合物納米顆粒和病毒載體為代表，促進了多種治療模式的快速發(fā)展，包括體細胞基因組編輯、基于 mRNA 的療法以及靶向癌癥治療。然而，一個主要且持續(xù)存在的限制仍然存在：它們被體內清道夫系統(tǒng)非選擇性清除，這大大降低了對目標組織的傳遞效率。在所有器官中，肝臟是 IDS 清除的主要場所，常駐的庫普弗細胞（KCs）作為主要的清道夫，可以捕獲大部分給藥劑量。目前減少肝臟 IDS 清除的策略主要依賴于抗污染表面改性、材料重新設計、KC 飽和和清道夫受體阻斷。盡管這些方法取得了部分成功，但仍有很大改進空間，特別是在通用性、安全性、肝臟選擇性和臨床可轉化性方面。

原理：
盡管在材料和工程優(yōu)化方面進行了大量努力，但對肝臟如何維持其清除IDSs的強大基礎能力鮮有關注。因此，識別調控KC-IDS相互作用的核心信號通路將使能夠實施根本不同的遞送增強策略，并適用于各種IDSs。鑒于腸道微生物群與肝臟之間的密切交流，我們假設存在一個腸-肝信號軸，以增強穩(wěn)定狀態(tài)下KC對外來物質（包括IDSs）的吞噬作用。
結果：
耗竭腸道微生物群或阻斷細菌感應受體顯著降低了肝臟清除率，并增強了各種IDSs的遞送效率，無論其化學成分或載荷類型如何。這些效果轉化為IDS基礎療法（包括體細胞基因組編輯和精準癌癥療法）的顯著療效提高。遞送效率的增強歸因于庫普弗細胞（KCs）的功能性失活，同時伴隨其形態(tài)學、分子表型和吞噬活性的明顯變化。革蘭氏陰性細菌被確定為此通路的主要驅動因素，但它們并非通過細菌衍生產物直接作用于KCs。相反，腸道細菌在腸上皮中調節(jié)色氨酸代謝，腸上皮來源的血清素成為連接腸道與KC介導的IDS清除的關鍵信使。血清素通過KCs上特定受體的信號傳導觸發(fā)KCs細胞骨架重塑，并上調吞噬相關基因的表達，從而廣泛增強了KCs對各種IDSs的攝取。從治療角度看，通過飲食限制血清素生產源或阻斷相關血清素受體實現的血清素信號瞬時干擾，可廣泛增強IDS遞送效率。短暫的干預窗口就足以在多種臨床相關的IDS基礎療法中實現顯著的治療益處。
結論：
本研究確定了一個共生菌驅動的腸-肝免疫軸作為IDS清除和系統(tǒng)性遞送效率的主要調控因子，表明通過調節(jié)內源性生物通路可以克服長期存在的藥物遞送障礙。從轉化醫(yī)學的角度看，針對色氨酸代謝或血清素信號的策略提供了一種廣泛適用的方法，通過減少快速的肝臟清除或肝毒性來改善IDS的性能，對基因療法、基于mRNA的治療以及精準癌癥療法具有良好的應用前景。

腸-肝免疫軸限制基于IDS的療法：

腸道微生物群通過維持穩(wěn)態(tài)高水平的肝臟清除功能損害IDS循環(huán)。腸上皮將微生物群衍生的刺激傳遞給肝臟，血清素作為關鍵信使驅動KC對IDS的吞噬。因此，只有少量IDS到達靶組織，導致在各種應用中治療效果不理想。NPs，納米顆粒；LNPs，脂質納米顆粒；PAMPs，病原相關分子模式。

人體體內藥物遞送實踐中，常面臨藥代動力學的挑戰(zhàn)，包括系統(tǒng)毒性高、組織靶向性效率低（如化療藥物）、穩(wěn)定性差（如核酸類藥物）、難以跨越生物屏障的生物利用度低（如脂溶性藥物）等。遞送載體系統(tǒng)（IDS）通過對藥物的高效封裝、穩(wěn)定保護與靶向遞送，可有效解決上述難題，支撐相關藥物轉化，因而在現代生物醫(yī)藥領域占有重要地位。

近十年來，以脂質納米顆粒（LNPs）、聚合物納米粒（PNP）和病毒載體為代表的體內遞送系統(tǒng)技術已成功推動腫瘤靶向化療、mRNA疫苗、基因療法等治療理念實現臨床應用。然而，遞送載體給藥后普遍存在快速清除問題，導致到達靶標組織的藥量極低（比如現有納米藥物向腫瘤的有效遞送劑量可僅占總劑量的0.7%以下），嚴重制約治療療效。根本原因在于，這些遞送系統(tǒng)在進入體內后，大部分會被肝臟中的枯否細胞快速清除，導致能夠成功抵達病灶的劑量不足5%，嚴重限制了其治療效果。

雖然已知單核-巨噬細胞系統(tǒng)（Mononuclear Phagocyte System，MPS）是介導這一清除過程的主要細胞群體，但當前學術研究仍缺乏安全普適的干預手段。遞送領域對該問題長期陷入“現象描述—機制缺失—單純載體篩選—效果有限且普適性差"的循環(huán)，難以突破這一核心瓶頸對遞送領域發(fā)展的制約。如何有效規(guī)避肝臟的單核-吞噬細胞系統(tǒng)捕獲，成為提升體內遞送系統(tǒng)效率的核心難題。

血清素（英語：Serotonin，全稱血清張力素，又稱 5-羥色胺和血清胺，簡稱為 5-HT）是一種在中樞神經系統(tǒng)和外周組織中廣泛存在的單胺型神經遞質，也被稱為“?快樂激素?"。血清素由色氨酸經色氨酸羥化酶轉化為5-羥色氨酸，再經5-羥色氨酸脫羧酶在中樞神經元及動物（包含人類）消化道之腸嗜鉻細胞中合成。它被普遍認為是幸福和快樂感覺的貢獻者。血清素在調節(jié)情緒、睡眠、食欲、認知和胃腸功能等方面發(fā)揮著核心作用 。人體約?90%的5-羥色胺?存在于胃腸道的腸嗜鉻細胞中。腸嗜鉻細胞（EC）是腸上皮上腸內分泌細胞的一種亞型，是外周5-羥色胺（5-HT）的主要來源。血清素主要經肝臟代謝為?5-羥基吲哚乙酸?（5-HIAA），由腎臟排出 。

為探討腸道微生物群對腫瘤靶向化療藥物遞送的影響，研究人員通過廣譜抗生素混合物（ABX）清除腸道菌群6周，多種化療藥物遞送系統(tǒng)的抗腫瘤效果在清除腸道菌群后顯著增強。在使用臨床獲批的脂質體多柔比星(Doxil)治療MC38結腸腺癌時，清除菌群的小鼠中有25%在150天后仍無瘤生存，其腫瘤部位的藥物累積量約為正常小鼠的兩倍。類似的效果在脂質體米托蒽醌（Lipo MXT）治療乳腺癌、白蛋白結合型紫杉醇（Nab-paclitaxel）以及聚合物納米粒遞送系統(tǒng)中均得到驗證，這些結果表明腸道微生物群削弱了基于IDS的化療的抗腫瘤療效。

病毒載體是另一種臨床可用的IDS，自組裝結構組件可作為藥物載體。這種抑制作用同樣存在于病毒載體類遞送系統(tǒng)中。在B16F10黑色素瘤模型中，靜脈注射溶瘤腺病毒（Oncolytic Adenoviruses, OAs）對正常小鼠僅產生約28%的腫瘤抑制，而在腸道微生物菌群清除的小鼠中，腫瘤消退率高達76%。這些結果表明腸道微生物群在病毒載體基礎的癌癥療法中普遍起負面作用。

為了解釋療效的改善，團隊研究了腸道微生物群是否影響IDS向腫瘤的遞送。在微生物群耗竭的情況下，熒光成像顯示合成IDS在多種腫瘤模型中的腫瘤累積量約增加兩倍，包括脂質體（Doxil）和由mPEG-b-PLGA組成的聚合物納米顆粒（NPs）（圖1 M和N）。對于病毒IDS，通過體內熒光成像顯示，ADV向腫瘤的遞送至少增加了三倍。總體而言，這些發(fā)現表明腸道微生物群對基于IDS的藥物遞送到腫瘤具有顯著抑制作用。

除了藥物遞送之外，基于IDS的基因遞送是另一項關鍵技術，使核酸治療的臨床應用成為可能，包括體細胞基因組編輯和蛋白質替代治療。研究人員首先使用mRNA或DNA為基礎的體細胞基因組編輯來研究腸道微生物群對基因遞送的影響。研究人員使用脂質納米顆粒（LNPs）遞送Cre mRNA（mCre@LNPs），并使用Cre報告株評估其編輯效率，該報告株可依據細胞熒光從tdTomato轉換為增強型綠色熒光蛋白（EGFP）來可視化基因編輯細胞。腸道微生物群耗竭顯著提高了編輯效率，在多個肝外器官（包括肺、脾和骨髓）中提高了5到15倍。研究人員還使用病毒載體，Cre表達的AAV 2/9血清型（Cre-AAV2/9），將Cre DNA遞送到同一小鼠株。腸道微生物群耗竭同樣顯著提高了編輯效率，在肺、外分泌胰腺、胰島、脾和骨髓中提高了3到10倍。

接下來，研究人員擴展這些發(fā)現，評估腸道微生物群對MC38腫瘤中基于IDS的蛋白質替代治療的影響。LNPs被用來遞送編碼腫瘤抑制蛋白PTEN的mRNA（mPTEN@LNPs）（圖1O）。作為對照，mPTEN@LNPs在腫瘤消除方面幾乎沒有效果，而腸道微生物群耗竭明顯增強了抗腫瘤效果，腫瘤體積減小幾乎增加了三倍，中位生存期延長了一倍（圖1P、Q）。為了直接量化腸道微生物群耗竭下腫瘤基因遞送的改善，研究人員向MC38腫瘤小鼠施用攜帶熒光素酶mRNA的LNPs（mLuc@LNPs）。腸道微生物群耗竭導致LNPs在腫瘤中的積累增加，并使腫瘤熒光素酶表達提高5.6倍，確認了腫瘤遞送的改善（圖1R）。這些發(fā)現揭示了腸道微生物群在限制基于IDS的基因遞送療法潛力方面的負面作用。

圖1. 腸道微生物損害遞送系統(tǒng)介導的藥物遞送與基因遞送。（B和C）腫瘤生長軌跡（B）和生存曲線（C）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （E和F）腫瘤生長軌跡（E）和生存曲線（F）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （H和I）腫瘤生長軌跡（H）和生存曲線（I）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （K和L）腫瘤生長軌跡（K）和腫瘤重量（L）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （M）有或無ABX處理小鼠MC38腫瘤中Doxil的熒光反射圖像。比例尺，2mm。 （N）注射后24小時Doxil的腫瘤蓄積量。數據以每克腫瘤組織注射劑量百分比表示，顯示為均值±標準差，n=4個生物學重復。 （P和Q）腫瘤生長軌跡（P）和生存曲線（Q）。數據顯示為均值±標準差，n=9個生物學重復。 （R）有或無ABX處理小鼠注射mLuc@LNPs后48小時的生物發(fā)光圖像和熒光素酶表達。數據顯示為均值±標準差，n=5個生物學重復。 （S）ABX處理和SPF對照小鼠皮膚血管中聚合物納米粒的活體顯微成像。比例尺，50μm。 （T）有或無ABX處理小鼠聚合物納米粒的藥代動力學曲線。數據顯示為均值±標準差，n=4個生物學重復。陰影區(qū)域代表標準差。

腸道微生物群如何影響IDS遞送的呢？對腫瘤血管結構和血液灌注的初步檢查顯示，在ABX處理下未觀察到顯著變化，這表明IDS在腫瘤中的遞送增強并非歸因于血管功能的改變。進一步使用聚合物納米顆粒（NPs）作為IDS模型進行藥代動力學分析顯示，腸道微生物群的耗竭顯著延長了納米顆粒在體內的循環(huán)時間，即使在注射后24小時，血清濃度仍約為對照組的兩倍（圖1，S和T）。此外，NP在腫瘤及其他重要器官的積累增加，而肝臟的NP信號明顯減少，提示肝臟清除受到抑制。這些結果表明，腸道微生物群通過刺激肝臟清除降低了IDS的遞送。為研究腸道微生物群控制肝臟清除的潛在機制，研究人員首先排除了細胞色素P450酶的參與，因為藥理學調控這些酶并未影響IDS遞送。隨后，研究人員使用高分辨率肝臟活體顯微鏡（IVM）成像在細胞水平上觀察IDS分布。IVM成像顯示，納米顆粒沿肝小葉竇快速沉積，而使用荷蘭Liposoma巨噬細胞清除劑氯磷酸脂質體Clodronate Liposomes耗竭巨噬細胞可消除NP沉積，并顯著增加血液中的NP濃度（圖S4，H和I）。對Kupffer細胞（KCs）進行體內熒光抗F4/80抗體染色顯示其強烈的NP攝取，提示其在肝臟NP清除中起核心作用（圖S4J）。

圖 S4. 腸道微生物群耗竭降低了 IDS 的肝臟清除率。提前兩天尾靜脈注射氯磷酸脂質體Clodronate Liposomes清除肝臟Kupffer細胞。以降低Kupffer細胞對NP的攝取。

高分辨率活體顯微鏡成像顯示，清除菌群后，位于肝門靜脈周圍的枯否細胞對納米顆粒的攝取減少了約70%，而肝中央靜脈區(qū)域的枯否細胞攝取也降低了40%，原本存在的區(qū)域吞噬異質性隨之消失。這種效應具有普適性，無論是脂質體、白蛋白納米粒、金納米粒等合成載體，還是腺相關病毒、腺病毒、慢病毒等病毒載體，其被枯否細胞捕獲的比例均顯著下降，導致遞送系統(tǒng)在血液循環(huán)中的滯留時間延長了近兩倍。通過糞便菌群移植恢復腸道菌群后，枯否細胞的吞噬活性和肝臟清除功能也隨之恢復，證實了腸道菌群對枯否細胞功能具有動態(tài)調節(jié)作用。

KCs在空間上被組織成門脈周圍（PT-KCs）和中心靜脈周圍（CV-KCs）兩個亞群 。使用熒光抗E-鈣黏蛋白抗體對體內門脈區(qū)進行標記，研究人員能夠區(qū)分PT-KCs和CV-KCs，并觀察到這些KC亞群之間吞噬活性存在差異（圖S4K）。PT-KCs的NP攝取高于CV-KCs（圖S4，L和M）。由于腸道微生物群衍生產物由門靜脈引流，在肝小葉竇中從PT到CV區(qū)域形成遞減濃度梯度，研究人員推測KC吞噬異質性的分區(qū)可能是由腸道微生物群建立的。與這一假設一致，ABX處理或無菌（GF）小鼠的IVM成像顯示，PT-KCs的NP攝取減少約70%，CV-KCs的NP攝取減少約40%，導致KCs的吞噬異質性消失（圖2A及圖S5，A到C）。這種減少在各種合成載體中均一致，包括白蛋白NPs、脂質體、LNPs和金納米顆粒（AuNPs），以及病毒載體，包括AAVs、ADVs和慢病毒（LVs）（圖2，A到C）。使用不同粒徑（0.13至1.3 μm）的IDS進一步確認了KCs攝取減少。通過糞菌移植（FMT）在ABX處理小鼠中恢復腸道微生物群，可增加PT-KCs和CV-KCs的吞噬活性，從而恢復肝臟清除并減少循環(huán)中的NPs。值得注意的是，盡管有這些變化，腸道微生物群耗竭或FMT處理后，KCs數量保持不變。這些發(fā)現表明，KCs的吞噬活性決定了肝臟IDS清除，并可被腸道微生物群動態(tài)調控。

圖2. 腸嗜鉻細胞（EC）對微生物的感知調控肝臟遞送系統(tǒng)清除。 （A）ABX處理和SPF對照小鼠中不同合成載體在枯否細胞中的標準化攝取，相對于對照小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為均值±標準差，n=4個生物學重復。 （B）有或無ABX處理小鼠枯否細胞形態(tài)及慢病毒吞噬的活體顯微成像。比例尺，20μm。 （C）ABX處理和SPF對照小鼠中不同病毒載體在枯否細胞中的標準化攝取，相對于SPF對照小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為均值±標準差，n=5個生物學重復。 （D）Tlr4fl/fl小鼠及內皮細胞、髓系細胞、肝細胞、B細胞和腸上皮細胞條件性Tlr4敲除小鼠中枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于Tlr4fl/fl小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=5個生物學重復。 （E）Myd88fl/fl及條件性Myd88敲除小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （F）Myd88fl/fl及條件性Myd88敲除小鼠中枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于Myd88fl/fl小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=5個生物學重復。 （G）Myd88fl/fl及條件性Myd88敲除小鼠門靜脈周圍枯否細胞和靜脈周圍枯否細胞形態(tài)學參數熱圖。n=5個生物學重復。 （H）Myd88fl/fl及條件性Myd88敲除小鼠分區(qū)枯否細胞聚類的主成分分析圖，顯示整體形態(tài)學變異。每個點代表一個分區(qū)枯否細胞聚類的平均特征。n=5個生物學重復。 （I）彩色編碼的主成分分析圖顯示枯否細胞內納米粒平均強度。n=5個生物學重復。 （J）Vil1Cre-Myd88wt/wt和Vil1Cre-Myd88fl/fl同窩小鼠肝臟和MC38腫瘤中Doxil蓄積的熒光反射圖像。比例尺，2mm。 （K和L）Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠接受Doxil治療后MC38腫瘤的生長軌跡（K）和生存曲線（L）。

接下來科研人員試圖了解腸道微生物群如何影響KC的吞噬活性。通過Z堆疊成像和三維（3D）重建結果顯示，ABX處理下的KCs表現出顯著的形態(tài)學改變，表現為細胞體積減少和偽足減少，并過渡為更緊湊、圓形的細胞形態(tài)，表明KC失活。

基于主成分分析（PCA）的整合形態(tài)特征降維后，相似特征的KCs被分組為離散簇，簇之間的距離反映形態(tài)變化的程度。對照組小鼠的PT-KCs和CV-KCs形成了不同的簇，這與它們具有異質化的吞噬活性一致。相比之下，腸道微生物群清除使兩個KC簇都從對照簇中偏移，形成一個重疊簇（圖S8C）。進一步分析顯示，KC形態(tài)與吞噬活性高度相關，例如凸區(qū)面積與吞噬作用呈正相關，而形狀因子呈負相關，表明這些形態(tài)特征可以作為KC功能的指示?？偟膩碚f，該研究提供了對腸道微生物群缺失下KC顯著形態(tài)變化的定量見解，這可能從細胞幾何的角度解釋KC吞噬能力下降的原因。

接下來研究人員試圖研究建立腸道菌群與KC之間遠程通信的潛在機制。為了確定負責的細菌種類，使用不同的抗生素在小鼠中選擇性地耗竭革蘭氏陽性或陰性細菌。使用萬古霉素耗竭革蘭氏陽性細菌可以適度增加KC對納米顆粒（NP）的攝取，而使用多粘菌素B消滅革蘭氏陰性細菌則顯著降低了KC的大小和吞噬活性。將益生菌大腸桿菌（Nissle 1917）移植到ABX處理的小鼠中恢復了KC的吞噬活性，證明了革蘭氏陰性細菌在維持KC活性中的重要性。

已有研究報道，腸道菌群通過將細菌產物釋放到血液中與腸外器官的免疫細胞進行交流。鑒于脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細菌中的主要病原相關分子模式，我們首先考察了腸道LPS對KC吞噬活性的影響。口服LPS給GF小鼠可劑量依賴性地恢復PT-KC和CV-KC的激活，并增強其NP清除能力。一致地，在缺乏LPS感受器Toll樣受體4（TLR4）或其下游適配蛋白MyD88的小鼠中，KC吞噬顯著下降，表明TLR4-MyD88信號通路在維持穩(wěn)態(tài)下KC吞噬活性方面的關鍵作用。

研究人員最初假設，KC會直接對來自腸道的LPS作出反應，從而以自反饋的方式維持其強大的清道夫功能。然而，使用Clec4f-Cre轉基因小鼠在KC中條件性敲除Tlr4或Myd88基因并未改變KC的吞噬活性。此外，口服LPS處理后血液中LPS濃度仍保持低水平。值得注意的是，口服LPS使KC功能表型轉向抗炎狀態(tài)，這與全身LPS暴露下觀察到的促炎激活不同。

在組織水平上，口服LPS處理增加了肝臟中抗炎介質轉化生長因子β（TGF-β）和白細胞介素10（IL-10）的濃度，進一步排除了KC直接識別LPS的必要性。一致地，口服LPS處理在ABX處理的Clec4f Cre-Myd88^fl/fl 小鼠中仍能有效驅動KC的抗炎激活。這些結果暗示了其他細胞群體作為中介，將腸道菌群的刺激信號傳遞給KC的參與。

追隨這一引人注目的概念，研究人員試圖確定哪一類細胞群體能夠感知微生物刺激并維持穩(wěn)態(tài)下的庫普弗細胞（KC）吞噬活性。研究人員使用多種Cre驅動小鼠品系，對腸道和肝臟中的關鍵細胞群體進行了細胞特異性TLR4-MyD88信號通路基因擾動，包括iCdh5-Cre（血管內皮細胞）、LysM-Cre（髓系譜系）、Alb-Cre（肝細胞）、CD19-Cre（B細胞）和Vil1-Cre（腸上皮細胞，IECs）。研究人員發(fā)現，肝臟細胞中的TLR4-MyD88信號通路，包括內皮細胞、KC和肝細胞，對于維持穩(wěn)態(tài)下的KC吞噬活性并非必需。相比之下，特異性刪除腸上皮細胞中的該通路（Vil1Cre-Tlr4fl/fl和Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠）顯著降低了KC對合成或病毒IDS的攝取，其水平可與全身敲除小鼠相媲美（圖2D至F）。

此外，在Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠中觀察到PT-KC和CV-KC的顯著形態(tài)學變化，而其他條件性敲除品系的小鼠KC保持不變（圖2G）。PCA分析進一步顯示，只有Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠的KC在形態(tài)特征空間中表現出明顯偏移，表明其功能發(fā)生了獨特轉變（圖2H）。

值得注意的是，腸上皮細胞中的Myd88缺失并未改變腸道微生物組成或腸道免疫活化狀態(tài)，從而排除了它們在調控KC功能中的參與。在Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠中，KC對納米顆粒（NPs）的攝取減少伴隨著IDS循環(huán)時間延長和腫瘤輸送增強（圖2I和J）。相應地，這些效應顯著提高了Doxil對MC38腫瘤的治療效果，在治療后的前兩周實現腫瘤生長抑制，并顯著延長存活期（圖2K和L）。這些結果確認腸上皮細胞是將腸道微生物刺激傳遞給KC的關鍵信號節(jié)點，從而許可肝臟對IDS的清除。

為了確定IEC如何遠程調控KC的吞噬活性，我們分析了IEC的分泌特征，并識別出35種可能受腸道微生物影響的分子。在分離的原代KC上測試這些分子表明，只有血清素（5-羥色胺，5-HT）能夠顯著刺激KC的吞噬活性，使IDS攝取量增加4.1至5.3倍（圖3A）。

此外，在Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠的血清、結腸和肝臟組織中，血清素濃度顯著降低，這提示其可能參與KC調控（圖3 B至D）。對Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠進行為期1周的口服血清素補充可恢復KC的形態(tài)和吞噬活性（圖3E）。在無菌（GF）、抗生素處理（ABX）及Myd88–/–小鼠中也觀察到類似結果。

血清素是由必需氨基酸色氨酸（Trp）代謝生成的一種小產物。進一步使用Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠探索血清素合成途徑中其他代謝物對KC的影響（圖3F）。盡管Trp是血清素合成的原料，但單獨補充Trp并未激活KC（圖3G）。然而，羥色氨酸（5-HTP）可恢復KC的吞噬活性，這表明芳香族L-氨基酸脫羧酶（AADC）在Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠中功能未受影響。我們還檢測了血清素代謝的主要產物5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）和Trp的替代代謝途徑主要產物犬尿氨酸（Kyn），結果兩者均未恢復KC功能，從而排除了這些代謝產物驅動的途徑參與的可能性（圖3G）。

為了進一步證明血清素的生理作用，我們使用了色氨酸羥化酶1（TPH1）基因敲除小鼠（TPH1–/–），在這些小鼠中IEC中的血清素生成被阻斷，因為TPH1是血清素合成限速步驟的酶。TPH1–/–小鼠的KC吞噬活性顯著降低，這證明血清素在穩(wěn)態(tài)下對KC具有調控作用（圖3 H和I）。除了評估吞噬活性和形態(tài)外，研究人員還考察了血清素在塑造KC功能表型中的作用。在ABX處理的小鼠中，口服血清素可恢復KC的抗炎表型，這表現為CD206、CD163、IL-10和TGF-β表達升高。相比之下，在TPH1–/–小鼠中口服LPS未能恢復KC表型。這些發(fā)現證實，血清素作為中心信使，在IEC對微生物刺激時對KC的長距離控制中發(fā)揮關鍵作用。

圖3. 腸嗜鉻細胞來源的血清素向枯否細胞傳遞微生物刺激信號。 （A）流式細胞術定量經腸上皮細胞來源代謝分子處理后分離的原代枯否細胞的吞噬活性。數據顯示為均值±標準差，n=3個生物學重復。 （B）SPF對照、ABX處理或Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠門靜脈血中血清素標準化濃度，相對于對照小鼠均值。數據顯示為均值±標準差，n=16個生物學重復。 （C和D）Vil1Cre-Myd88wt/wt和Vil1Cre-Myd88fl/fl同窩小鼠肝臟中血清素的免疫組化染色（C）及信號強度定量（D）。數值以Vil1Cre-Myd88wt/wt小鼠均值標準化。比例尺，20μm。數據顯示為均值±標準差，n=5個生物學重復。 （E）有或無血清素補充的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （F）示意圖顯示色氨酸生成血清素的代謝通路。 （G）Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠補充參與血清素生成的各種代謝物后枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于對照小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=4個生物學重復。 （H）TPH1-/-和野生型同窩小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （I）TPH1-/-和野生型同窩小鼠中枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于野生型同窩小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=4個生物學重復。 （J）基于免疫組化染色的Vil1Cre-Myd88wt/wt和Vil1Cre-Myd88fl/fl同窩小鼠結腸中ATB0+、TPH1、SERT和MAO-A的表達。對于ATB0+和TPH1，數值以Vil1Cre-Myd88wt/wt小鼠均值標準化。數據顯示為均值±標準差，n=5個生物學重復。 （K）示意圖顯示腸道微生物調控腸上皮細胞中血清素的代謝通路及其生物合成與降解。

接下來研究了 IEC 中的 MyD88 信號如何通過檢查三條關鍵通路來調節(jié)血清中血清素濃度：色氨酸 (Trp) 吸收、血清素生物合成和血清素降解。通過分析這些通路中關鍵蛋白的 mRNA 表達，我們發(fā)現 IEC 中 Myd88 的基因缺失降低了 Trp 吸收轉運蛋白 ATB0 (Slc6a14) 和血清素生物合成酶 TPH1 的表達。這解釋了為什么 Vil1Cre-Myd88^fl/fl 小鼠中的 KC 對 Trp 補充仍無反應。關于血清素降解通路，IEC 通過血清素再攝取轉運蛋白 (SERT) 從腸粘膜吸收血清素，并通過單胺氧化酶 A (MAO-A) 進行降解 。IEC 中 Myd88 的缺失顯著增加了 SERT 和 MAO-A 的表達，這與 ATB0 和 TPH1 活性的下調共同加強了血清血清素的降低（圖 3J ）。在 Vil1-Cre 靶向的 IEC 系列中，小腸上皮細胞負責 Trp 吸收和血清素降解，腸嗜鉻細胞負責血清素合成。利用 SERT-Cre、Neurod1-Cre 和 iTPH1-Cre 系列在這些細胞中進行亞群特異性 Tlr4 或 Myd88 缺失進一步顯示，這兩類細胞均參與微生物驅動的血清素產生和肝臟 IDS 清除，而其他 IEC 亞群則非必需?？偟膩碚f，這些發(fā)現表明腸道微生物通過影響 IEC 中血清素的合成和降解維持血清血清素濃度（圖 3K）。

短鏈脂肪酸 (SCFA) 已被報道可刺激腸嗜鉻細胞產生血清素。與此一致，SCFA 補充可提高小鼠血清血清素濃度，但矛盾的是抑制了 KC 活性。敲除編碼 SCFA 受體的基因 (GPR41, GPR43 和 GPR109A) 或通過無纖維飲食耗盡野生型 (WT) 小鼠腸道 SCFA 增強了 KC 對納米顆粒 (NPs) 的攝取，而在 TPH1–/– 小鼠中，SCFA 處理在缺乏血清素的情況下進一步降低了 KC 吞噬作用。這些結果表明 SCFA 對 KC 吞噬活性具有額外的抑制作用，超過了其通過誘導血清素而介導的 KC 激活作用。

SCFA 主要由革蘭氏陽性菌產生，這與萬古霉素處理小鼠中觀察到的顯著 KC 激活一致。向這些小鼠補充 SCFA 使 KC 吞噬活性恢復至對照水平，證實革蘭氏陽性菌通過 SCFA 抑制 KC 吞噬?？偟膩碚f，革蘭氏陽性菌通過 SCFA 信號抑制 KC 吞噬，但這一作用弱于革蘭氏陰性菌的促吞噬作用。這解釋了在通過 ABX 引起的廣泛共生菌耗竭時觀察到的 KC 活性降低，強調血清素信號在調節(jié)肝臟 IDS 清除中的主導作用。

鑒于色氨酸是只能從食物中獲得的必需氨基酸，研究人員接下來探討其限制攝入是否通過降低血清血清素濃度而改變肝臟IDS清除。為期3天的無色氨酸飲食顯著降低了血清血清素濃度。KC吞噬活性的下降與循環(huán)血清素濃度的下降同步，兩者在5天內均達到低點(圖 3L)。

將小鼠重新喂以標準飲食后，血清血清素濃度迅速恢復，同時KC形態(tài)和吞噬活性在3天內恢復。這一快速反應建立了血清血清素濃度與KC吞噬活性之間的強相關性(圖 3M)。
此外，除了合成IDS之外，無色氨酸飲食還會導致肝臟對包括AAV、ADV和LV在內的病毒載體的清除率下降約70%(圖 3N )。這些發(fā)現表明KCs對血清血清素的敏感性，并提供了通過膳食干預控制肝臟清除的潛在方法。

研究人員接下來探索了IEC來源血清素在KCs中的下游信號通路。為了確定負責的血清素受體（HTRs），我們用不同的HTR激動劑處理Vil1Cre-Myd88fl/fl和WT小鼠。在使用HTR2或HTR7激動劑處理的小鼠中觀察到KCs的活化，表現為其形態(tài)變化和吞噬活性增加，提示多種HTR亞型的參與（圖4A和B）。

具體來說，HTR2包括三個亞型：HTR2a、HTR2b和HTR2c。為了區(qū)分它們對KCs的影響，我們生成了相應的HTR基因敲除小鼠品系，并檢查了其KCs的活性（圖4C和D）。基因刪除HTR2c或HTR7，而非HTR2a和HTR2b，會引起KCs的形態(tài)轉變并顯著降低其吞噬活性，從而確認了負責的血清素受體（圖4C和D）。

由于HTR2c–/–和HTR7–/–小鼠的KCs表現出相似的表型，猜想這兩個受體可能共享共同的下游信號通路。關注于參與執(zhí)行HTR激活后匯聚效應的細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）。免疫印跡分析證實血清素處理的KCs中ERK磷酸化增強（圖4E）。為了進一步驗證這一點，向血清素處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl或SPF小鼠施用ERK抑制劑（ERKi, PD98059）消除了血清素對KCs攝取NP的刺激作用，并顯著抑制了KCs的活性（圖4F和G; ）。ERKi處理還引起KCs明顯的形態(tài)轉變，表現為細胞體圓形、細胞突起減少和偽足縮短（圖4H和I）。這些發(fā)現表明ERK在執(zhí)行KCs中HTR激活下游功能中具有關鍵作用。

圖4. 血清素通過HTR2c/7-ERK信號通路激活枯否細胞吞噬活性。 （A）不同HTR1、HTR2、HTR3和HTR7激動劑處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （B）不同HTR激動劑處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于對照小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=4個生物學重復。 （C）HTR2a-/-、HTR2b-/-、HTR2c-/-、HTR7-/-及野生型小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （D）HTR敲除小鼠中枯否細胞對聚合物納米粒的標準化攝取，相對于野生型小鼠門靜脈周圍枯否細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=3個生物學重復。 （E）血清素處理后原代枯否細胞中ERK磷酸化的免疫印跡分析。數據顯示為均值±標準差，n=4個生物學重復。 （F）單獨補充血清素或血清素聯合ERK抑制劑處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞形態(tài)及聚合物納米粒吞噬的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （G）單獨補充血清素或血清素聯合ERK抑制劑處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠分區(qū)枯否細胞聚類的主成分分析圖，顯示整體形態(tài)學變異。n=5個生物學重復。 （H）單獨補充血清素或血清素聯合ERK抑制劑處理的Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞偽足結構的掃描電鏡圖像。比例尺，5μm和1μm（插圖）。 （I）掃描電鏡數據中枯否細胞偽足的數量和長度。數據顯示為中位數±四分位數，n=4個生物學重復。 （J）從Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠分離的枯否細胞中F-肌動蛋白組織的熒光圖像?？莘窦毎麊为氂醚逅鼗蜓逅芈摵螮RK抑制劑處理24小時，隨后與聚合物納米粒孵育3小時。比例尺，20μm和5μm（插圖）。 （K）培養(yǎng)的枯否細胞中單獨用血清素或血清素聯合ERK抑制劑處理后F-肌動蛋白的長度（上）和標準化強度（下），相對于未處理細胞均值。數據顯示為中位數±四分位數，n=4個生物學重復。 （L）血清素處理相對于未處理Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠枯否細胞中髓系白細胞活化（上）和吞噬作用（下）的基因集富集分析圖。n=3個生物學重復。 （M）血清素處理后從Vil1Cre-Myd88fl/fl小鼠分離的枯否細胞中mRNA水平基因表達變化的熱圖。n=3個生物學重復。 （N）示意圖顯示腸上皮細胞來源的血清素激活枯否細胞對遞送系統(tǒng)吞噬的機制。血清素通過HTR2c和HTR7信號觸發(fā)枯否細胞中肌動蛋白重塑和吞噬受體表達，導致枯否細胞對遞送系統(tǒng)的高水平吞噬活性。

接下來，研究人員探討了血清素-HTR-ERK信號在KC中的下游效應分子。吞噬作用需要細胞骨架、吞噬受體和其他調控因子的協(xié)作。首先在血清素作用下檢查了KC的細胞骨架重塑，使用鬼筆環(huán)肽可視化纖維狀肌動蛋白（F-actin）。在來自Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠的分離KC中觀察到肌動蛋白聚合較弱，這與其顯著的細胞形態(tài)變化相對應（圖4J）。相反，補充血清素增強了胞質F-actin的形成，生成密集的肌動蛋白網絡，支持KC的偽足和突起（圖4J和K）。這種重塑的細胞骨架結構對于KC在竇狀腔內導航并捕獲循環(huán)的納米顆粒以啟動吞噬至關重要。

給予血清素處理的Vil1Cre-Myd88^fl/fl或SPF對照小鼠ERK抑制劑（ERKi）可減少其細胞內F-actin積累并抑制偽足形成。此外，在從人肝分離的KC中，血清素誘導明顯的形態(tài)變化、細胞骨架重塑以及2.4倍的納米顆粒攝取增加，而ERKi可有效阻斷這些效應。這些結果凸顯了血清素-ERK軸在調控KC細胞骨架動力學和吞噬活性中的保守作用。

為評估血清素對吞噬相關基因表達的影響，研究人員比較了血清素處理與未處理Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠KC的轉錄組?；蚣患治觯℅SEA）和基因本體分析顯示，參與髓系白細胞激活、吞噬作用和ERK1/2信號級聯的基因主要在血清素處理的Vil1Cre-Myd88^fl/fl小鼠KC中富集（圖4L）。具體而言，血清素上調了多種吞噬觸發(fā)受體的表達，包括清道夫受體、Fc受體、補體受體、C型凝集素受體及其他模式識別受體（圖4M）。值得注意的是，Marco（一種最近被證明介導肝臟對腸源性細菌及靜脈注射IDS的免疫清除的清道夫受體）的表達增加了2.2倍，而上調的C型凝集素受體和補體受體對于識別和吞噬血源性病毒至關重要。這些吞噬觸發(fā)受體的上調也通過流式細胞術在蛋白水平得到確認。血清素處理還增加了巨噬細胞刺激受體的表達，如Csf1r、Trem1和Trem2，這些受體均負責維持KC的高吞噬活性（圖4M）。此外，調控吞噬作用的基因，如Calr和Coro1a，也呈上調，它們對于細胞骨架重塑和啟動吞噬至關重要?？偟膩碚f，這些結果揭示了血清素在KC中的下游信號通路，并提供了血清素如何在穩(wěn)態(tài)下維持KC對IDS高吞噬活性的機制性解釋（圖4N）。在應用層面，研究人員探討了以臨床可轉化的方式中斷血清素通路是否可以提高IDS的遞送效率。首先檢查了血清素受體阻斷的效果。為了確定抑制肝臟IDS清除的藥物，研究人員向SPF小鼠給藥了針對不同HTR亞型的小分子拮抗劑。在這些藥物中，HTR2或HTR7拮抗劑削弱了KCs對納米顆粒的攝取，而ritanserin和AVN-101顯示出好的療效（圖5，A和B）。兩種藥物的聯合使用在降低KCs的吞噬活性方面更為有效（圖5B）。

因此，我們的主要策略依賴于ritanserin和AVN-101的組合（HTR拮抗劑混合物）直接阻斷KCs中的血清素信號通路（圖5，C和D）。為期一周的治療方案未引起腸道微生物群失調，但顯著延長了Doxil在系統(tǒng)循環(huán)中的半衰期，并顯著增強了Doxil和聚合物納米顆粒在腫瘤中的積累（圖5，E和F）。值得注意的是，AVN-101和ritanserin均已成功通過多項I期臨床試驗用于治療神經系統(tǒng)疾病。在本研究中，研究人員發(fā)現能夠有效降低肝臟IDS清除的劑量處于可耐受范圍內，這強調了該策略的臨床轉化潛力。

隨后，評估了該策略對腫瘤治療和基因編輯的效果。HTR拮抗劑混合物對腫瘤生長影響較小（圖5，G和H），但顯著增強了Doxil對MC38腫瘤的治療效果，實現了比單獨使用Doxil更高的腫瘤抑制率和延長的生存期。在原位B16F10腫瘤模型中，OAs與HTR拮抗劑混合物聯合治療也顯示了類似的腫瘤抑制效果（圖5I）。在基因遞送方面，HTR阻斷顯著提高了Cre-AAV2/9在肺、胰腺、脾臟和骨髓等多個器官的基因組編輯效率。

第二種策略涉及限制色氨酸（Trp）攝入，以快速降低血清血清素濃度（圖5J）。5天的無色氨酸飲食使LNP在腫瘤中的遞送效率翻倍，而外源性血清素的給藥則抵消了這種遞送改善（圖5K）。恢復色氨酸攝入可快速糾正血清血清素濃度，使該策略成為一種有效且可控的提升IDS遞送效率的方法。對于使用mCre@LNPs進行體細胞基因組編輯，無色氨酸飲食相比等熱量對照飲食的小鼠，在不同器官中誘導了5至15倍的編輯效率提升。對于蛋白質替代療法，無色氨酸飲食增強了mPTEN@LNPs對原位4T1腫瘤的療效，在實驗結束時實現了約65%的腫瘤體積減少而未引起體重下降（圖5, L和M）。

對于溶瘤病毒療法，無色氨酸飲食同樣增強了OAs在B16F10腫瘤模型中的腫瘤消融效果，即便是初始體積超過500 mm3的晚期腫瘤，也顯示了該策略的高效性和廣泛適用性（圖5, N和O）。值得注意的是，恢復血清血清素濃度會抵消色氨酸限制賦予的病毒療法治療改進（圖5, N和O）。血清血清素濃度與病毒療法結果之間的穩(wěn)健相關性表明，血清血清素濃度可能作為IDS基礎治療療效的臨床可評估指標，并為患者飲食管理提供動態(tài)信息（圖5P）?？傊覀兊难芯拷Y果強調，阻斷血清素信號是一種有前景的方法，可減輕非特異性肝臟IDS清除，從而提升臨床相關IDS基礎治療的效果。

圖5. 通過靶向血清素信號增強遞送系統(tǒng)介導的治療效果。 （A）HTR拮抗劑雞尾酒或對照溶液處理的SPF小鼠枯否細胞對聚合物納米粒攝取的活體顯微成像。比例尺，100μm和20μm（插圖）。 （B）血清素信號阻斷示意圖：使用TPH1抑制劑（LP-533401）或HTR2c/7拮抗劑（ritanserin和AVN-101）。 （C和D）HTR拮抗劑雞尾酒預處理后MC38腫瘤攜帶小鼠接受Doxil治療的腫瘤生長軌跡（C）和生存曲線（D）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （E和F）HTR拮抗劑雞尾酒預處理后MC38腫瘤攜帶小鼠接受mPTEN@LNPs治療的腫瘤生長軌跡（E）和生存曲線（F）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （G和H）HTR拮抗劑雞尾酒預處理后B16F10腫瘤攜帶小鼠接受溶瘤腺病毒治療的腫瘤生長軌跡（G）和腫瘤重量（H）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （I）色氨酸缺失飲食或對照飲食處理的小鼠門靜脈血中血清素濃度。數據顯示為均值±標準差，n=5個生物學重復。 （J）色氨酸缺失飲食處理期間和停止后枯否細胞中聚合物納米粒攝取的代表性活體顯微成像。比例尺，100μm。 （K）色氨酸缺失飲食處理期間和停止后枯否細胞中聚合物納米粒攝取的定量分析。數據顯示為均值±標準差，n=4個生物學重復。 （L和M）色氨酸缺失飲食預處理后原位4T1腫瘤攜帶小鼠接受mPTEN@LNPs治療的腫瘤生長軌跡（L）和腫瘤重量（M）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （N和O）色氨酸缺失飲食或色氨酸缺失飲食聯合血清素補充預處理后B16F10腫瘤攜帶小鼠接受溶瘤腺病毒治療的腫瘤生長軌跡（N）和腫瘤重量（O）。數據顯示為均值±標準差，n=8個生物學重復。 （P）血清素濃度與溶瘤病毒治療后腫瘤重量的相關性分析。

總之，本研究揭示了一條由腸道菌群驅動、通過腸道上皮細胞來源的血清素激活肝臟枯否細胞、從而清除體內遞送系統(tǒng)的“腸-肝免疫軸"。這一發(fā)現不僅從根本上解答了體內遞送系統(tǒng)（IDS）為何在體內被快速清除的長期表象疑問，更提出了一種全新的、高度可轉化的策略來提升各類遞送系統(tǒng)的性能。研究揭示了驅動體內遞送載體（IDS）發(fā)生非選擇性肝臟富集的底層機制，深化了對體內遞送過程的認知，普適性地將傳統(tǒng)材料的遞送上升到新的機制高度，為藥物遞送載體的設計與應用提供了理論框架；為轉化應用提供了輔助遞送策略，為推動藥物遞送相關療法的發(fā)展、精準治療與臨床轉化提供了新視角與新靶點。

荷蘭Liposoma是巨噬細胞清除劑Clodronate Liposomes氯磷酸鹽脂質體的發(fā)明人。作為領頭的體內單核巨噬細胞清除試劑，其憑借穩(wěn)定的化學性質、高效的清除能力及良好的生物相容性，已成為單核巨噬細胞清除的不二藥物。產品被引頻頻見刊Cell，Nature和Science，助力突破發(fā)現，拓展科學邊界。

本Science論文，研究人員就使用了荷蘭Liposoma的巨噬細胞清除劑氯磷酸鹽二鈉脂質體Clodronate Liposomes，貨號C-005，通過尾靜脈注射，清除肝臟KF巨噬細胞 。

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原始文獻：

Qin Wang et al., Commensal-driven serotonin production modulates in vivo delivery of synthetic and viral vectors. Science 391,eadu7686(2026).DOI:10.1126/science.adu7686